Ngày 10 tháng 05 năm 1989, sau khoảng thời gian dài tu học và gián đoạn, Phó tế Nguyễn Văn Khôi được thụ phong linh mục[3] bởi Giám mục Phaolô Huỳnh Đông Các, tại Nhà thờ chính tòa Qui Nhơn.[4]

Từ năm 1989 đến năm 2000, ông là linh mục Chánh xứ Nam Bình, từ năm 1994 đến năm 2000, ông còn Giáo sư Triết học Đại Chủng viện Sao Biển Nha Trang. Sau đó, từ năm 2000 đến năm 2005, ông du học tại Đại học Giáo hoàng Urbaniana, Rôma, đậu Tiến sĩ Thần học Luân lý.[3]

Sau khi về Việt Nam, linh mục Nguyễn Văn Khôi đảm nhiệm vai trò linh mục chánh xứ giáo xứ Chính Toà Quy Nhơn. Ngoài ra, trong cùng thời gian này, linh mục Khôi còn đảm nhiệm vai trò Giáo sư Thần học Luân lý tại Đại chủng viện Sao Biển, giáo phận Nha Trang, nằm trong Ban thường huấn Giáo phận Qui Nhơn và linh mục Hạt Trưởng hạt Bình Định từ 2006.[3][4]